Endotoxin의 제거 이유와 방법

Endotoxin이란 내독소로 불리며, 바이오의약품을 생산할 때 이를 제거하는 것은 필수적입니다. 이번 포스팅은 endotoxin이 무엇이고, 왜 제거해야 하는지 그리고 제거 방법에 대해서 알아보겠습니다. 

 

Endotoxin이란?

대부분의 종에서 LPS는 O-antigen, core lipopolysaccharide, lipid A로 구성되어 있고, 그중에서도 lipid A가 endotoxin의 가장 biological activity를 띄는 독성을 가지고 있습니다.  

• Endoxin 또는 LPS 즉, Lipopolysaccharide라고 불립니다. 많은 실험실이나 바이오 및 제약회사에서 바이오 의약품을 생산할 때, 정제공정을 거치고 시료의 독소를 제거하는 과정이 바로 endotoxin을 제거하는 과정이 되겠습니다. 

경제적 그리고 시간적인 이유로 대장균을 이용하여 원하는 단백질들을 생산합니다. 그러나 대장균의 단백질 생산이 끝나면, 우리는 대장균의 세포벽이 깨트려 세포가 터지게끔 만들어서 단백질들을 수거하는 과정을 거칩니다. 이때, 세포벽의 외막에 존재하는 entotoxin이 함께 단백질과 흘러나와 분리가 되지 않고, 계속해서 단백질과 함께 붙어 다닙니다. 그래서 특별히 제거 방법을 적용해 없애주는 과정을 따로 거쳐야 하는 독소입니다. 

 

제거 이유

• 동물 및 임상 실험에 적용할 시료에 존재한다면 부작용을 일으키는 원인이 될 물질이기 때문입니다.  

내독소가 혈류에 유입되면, 발열성을 띄며 여러 면역 반응을 일으키게 됩니다. 그래서 패혈증이나 장기부전 및 쇼크의 원인이 되어, 제대로 된 실험이 진행되지 않기 때문입니다. 

그래서 endotoxin을 주입할 수 있는 제한된 양보다 적게끔 제거하여 실험을 진행해야 합니다.

FDA에 따르면, 사람의 경우 5 EU/kg으로 제한하고 있으므로, 만약 70 kg의 사람에게 시료를 주입하기 위해서는 350 EU가 넘지 않아야 하는 것입니다. 

※ EU = Endotoxin Unit 

제거 방법

Endotoxin은 실험 도구나 기구인 glass bottle이나 plastic ware에 많이 들어붙어 있고, 흔하게 하는 멸균작업인 autoclave를 돌려도 125℃에 제거되지 않습니다. 그래서 초고온에 멸균을 하거나 산이나 알칼리에 노출시켜 제거하는 방법이 있습니다. 

• 180℃ 이상의 온도에서 3시간 이상 노출시킨다. 
• 250℃ 이상의 온도에서 30분 이상 노출시킨다. 
• 0.1M 알칼리나 산의 환경에 노출시켜 endotoxin을 파괴시킨다.

이처럼 위의 방법으로 제거할 수는 있습니다. 하지만 바이오의약품을 개발하는 시료나 실험실 규모에서 생산하는 단백질들의 경우, 단백질의 안정한 상태를 유지해야 합니다. 급격한 온도나 pH의 변화는 단백질의 변성에 아주 치명적인 원인이 되기 때문에, 위의 방법은 시료가 있는 상태에서는 제거할 수는 없고, 몇몇의 실험기자재에만 적용시킬 수 있겠습니다. 

 

시료 및 단백질을 안정하게 유지하면서 제거하는 방법 

• Ion exchange chromatography

음이온 교환 방식의 정제 방법으로, 타깃 단백질보다 endotoxin이 레진에 더 강한 결합을 하게 만들어서 제거할 수 있습니다. 이 방법으로 제거한다면, 타깃 단백질은 칼럼에서 바로 빠져나오게 만들어서 회수하고, LPS는 레진에 붙어있는 상태로 만드는 것이 중요합니다. 그러나 LPS가 타깃 단백질이 가지는 레진과의 친화도와 유사할 가능성이 있습니다. 그래서 이 방법이 적용되지 않을 경우에는 아래의 방법 또한 시도해볼 수 있습니다.  

• Detergent (Triton X-114) 

두 번째 방법으로, detergent Triton X-114를 이용하는 것입니다. Triton X-114를 solution에 넣어서 phase를 2개로 분리하여 endotoxin을 제거하는 방법인데, 이때 해당하는 detergent의 CMC보다 더 많이 처리하여 rich part와 poor part로 나누어지게 만듭니다. 그리고는 rich part에 lipid A의 chain과 detergent으 tail과 상호작용하게 만들어 bottom에 위치하게 하고, poor part에 타깃 단백질들이 머물도록 온도 처리나 원심분리를 통하여 phase 분리를 통한 제거 방법입니다. 

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이외에도 여러 방법들이 있으나, 대표적으로 많이 사용하는 엔도톡신 제거 방법 2가지를 소개해드렸습니다. 실험적으로 protocol이나 자세한 방법들은 관련 논문을 찾아보시는 것이 가장 좋은 방법입니다. 이 글을 통해 endotoxin에 대한 대략적인 지식만 얻었더라도 저에겐 값진 포스팅이 될 듯합니다.