PCR의 원리와 준비물 & 쉽게 하는 방법

최근 코로나 바이러스의 진단 때문에 많은 사람들이 알려지게 된 생명공학기술이며, 목적하는 유전자를 증폭하는 기술로써 유전자를 다루는 실험실에서 흔히 사용되는 실험 기술인 PCR을 소개해드립니다. 그리고 PCR 쉽게 하는 방법과 팁을 드리도록 하겠습니다.  

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PCR

PCR이란?

• PCR은 Polymerase Chain Reaction의 줄임말로 시험관 내에 DNA 또는 RNA의 특정 부위를 증폭하는 기술입니다.

 

PCR의 3단계

• Denaturation (변성)

Double strand인 DNA template를 single strand로 분리해주는 작업을 Denaturation이라고 합니다. PCR을 할 때는 template가 single strand로 분리되고, 분리된 template에 primer가 붙어서 합성하는 사이클을 진행하기 위한 첫 번째 단계입니다. 주로 94~95℃에서 15~30초 정도 처리해줍니다.   

• Annealing (접합)

Forward, reverse primer가 template에 붙는 단계를 말합니다. 위에 primer의 설명에서 언급했듯이, primer에 따라 annealing 온도가 달라집니다. 그리고 PCR product의 size에 따라 10~30초 범위 내에서 유동적입니다. 물론 크기가 커질수록 시간이 늘어나는 것이죠.

• Extension (신장)

Template에 primer가 붙은 뒤에 채워지지 않은 서열들을 dNTP와 DNA polymerase에 이해 채워지는 신장 단계를 말합니다. 이 또한 PCR product size에 따라서 시간이 늘어나며, 온도는 72℃로 고정이라고 생각하시면 됩니다.

Annealing과 extension 단계에서 설정해야 하는 온도와 시간을 정확히 얘기하기가 힘든 것은 DNA polymerase의 종류와 primer 그리고 PCR product의 크기 등 많은 것들이 관여하기 때문입니다. 주로 사용할 DNA polymerase나 master mix 제품의 매뉴얼을 보면, 권장하는 온도와 시간이 적혀 있을 것입니다. 그걸 참고하는 것이 가장 정확한 방법이 되겠습니다.

PCR에 필요한 준비물

1. Template (주형가닥)

Template로는 DNA 뿐만 아니라, RNA도 이용되고 RT-PCR을 통해 얻어진 cDNA를 주형가닥으로 사용합니다. 그리고 형질 전환된 대장균의 colony를 template로 사용하여 PCR을 해서 목적하는 band가 존재하는지 파악하기도 합니다. 유전자 검사와 코로나 바이러스 진단에 머리카락과 타액 등을 이용하는 것도 이것들이 template로써 사용되기 때문입니다.

 

2. Primer

Template가 denaturation 되어 단일가닥으로 된 후에, 증폭하고자 하는 서열이 담긴 primer는 template에 annealing 단계에서 붙게 됩니다. 일반적으로 18~25 mer의 길이로 디자인을 하고, 사용되는 annealing 온도는 52~68℃의 넓은 범위를 가지는데, 이것은 primer의 Tm값에 의존하여 보통 Tm-2℃를 사용하여 PCR을 진행합니다. 그렇지만 PCR product를 확인했을 때, non-specific band가 자주 검출되는데 이 때는 annealing 온도를 높여서 mismatch를 줄여주는 것이 좋습니다. 아니면 처음부터 적절한 annealing 온도를 스크리닝 하는 gradient PCR을 한 후에 최적의 온도를 선택하는 것이 시간을 절약할 수 있습니다.

Primer design을 하는 것에는 고려해야 할 사항들이 많으니, 다음 기회에 단독 포스팅을 해보겠습니다.

 

3. dNTP

deoxynucleoside triphosphate의 줄임말이죠. dNTPs에는 dATP, dTTP, dCTP, dGTP가 포함되어 있는데 이를 통틀어 dNTP라고 얘기하는 것입니다. DNA polymerase가 mispriming이 생긴다면 dNTP의 농도가 이유가 됩니다. 그래서 dNTP의 농도를 낮추는 것이 PCR의 합성 오류율을 줄일 수 있습니다. 농도는 20~200 µM의 범위 내에 맞추는 것이 좋습니다.

 

4. 내열성 DNA Polymerase

Primer가 template에 붙으면 dNTP가 template의 상보적 서열에 맞춰서 합성할 수 있게 도와주는 효소입니다. 여러 종류의 내열성 DNA polymerase가 있지만, 주로 사용하는 것은 Taq와 Pfu입니다. 서로 다른 균주의 이름에서 유래되어 명명이 되었고, 최신 버전이 Pfu입니다. 아무래도 옛날 버전인 Taq에서는 없는 Pfu에 proof reading (3’-5’ exonuclease) 기능이 있어 fidelity가 높은 이유로 Pfu를 많이 사용하는 추세입니다.

 

5. Mg 농도 (일반적으로 1.5~2.5 mM)

enzyme의 활성과 primer의 annealing에 관여하는 역할을 합니다. 또한 dNTP와의 농도와도 관계가 있기 때문에 유효한 농도 설정이 중요합니다. 그리고 농도가 너무 높으면 template의 변성이 잘 되지 않기 때문에 이 또한 고려해야 합니다.  

 

PCR 쉽게 하는 방법

• Pfu master mix를 사용하면 됩니다. 
• 그리고 해당 제품의 매뉴얼에 따라 PCR 조건을 설정해서 반응시킵니다. 

이 제품은 template와 primer를 제외한 PCR에 필요한 조성들이 모두 적절히 배합된 제품입니다. 옛날에는 조성대로 하나하나 넣어줘야 했지만, 이제는 mix 제품이 있기 때문에 이를 사용하는 것이 실험 오류를 줄이고 노동력을 덜 수 있게 됐죠. mix 된 제품으로 PCR tube에 적당량을 하나씩 넣어줘야 하는 방식이 있고, 아예 처음부터 PCR tube에 넣어져 있는 제품이 있습니다. 후자가 더 좋다는 것은 굳이 자세히 얘기하지 않아도 아실 테죠. 경제적으로 여유로울수록 몸이 편한 것은 과학계에서도 적용되는 이치입니다. 

아래의 제품은 홍보 목적이 아니니 참고만 하시길 바라겠습니다. 이외에 다른 브랜드의 제품들도 다양하니 비교해보시고 구매하시면 되겠습니다. 

https://www.bioneer.co.kr/20-k-2022-cfg.html

AccuPower® Pfu PCR PreMix & Master Mix

 

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