DNA work를 하는 실험실에서는 주로 agarose gel을 이용해서 DNA를 분석합니다. PCR product나 enzyme 처리를 한 것을 확인하는 것이 목적이죠. 오늘은 이 agarose gel을 제조하는 방법과 DNA 크기별 농도에 대해 소개해드리겠습니다.
Agarose gel이란 무엇인가?
Agarose는 흔히 아는, 한천의 주성분 두 개를 하나로 정제한 것입니다. agarose와 agaropectin으로 한천의 주성분인 다당류를 구성하는데, 실험의 목적에 의해 agarose만을 정제하여 DNA의 분리 및 분석에 사용됩니다. agarose는 선형의 polymer이며, 이들은 수소결합으로 연결되어 있습니다. agarose gel은 polymer의 수소결합이 끊어짐과 다시 결합되는 과정에 따라서 연결된 polymer 간의 틈이 생기는데, 이 틈이 DNA를 분석하는 50~20,000 Da의 크기를 분석하는 것에 딱 맞아떨어졌던 것입니다. 거기다가 agarose는 탁도도 낮아서 분석하기 아주 편합니다.
한천은 투명한 도토리묵처럼 생겼습니다. 도토리묵도 물을 많이 넣으면, 잘 깨지고 다루기가 힘들지만 물을 적게 넣으면 더 단단한 도토리묵이 됩니다. agarose gel도 이와 같이, 적절한 농도 범위 내에서 제조를 하는데요. 주로 0.7~2% 사이의 농도로 gel을 분석하곤 합니다. 농도가 낮으면 pore size가 커지고, 농도가 높으면 pore size가 낮아지는 것입니다. 그래서 큰 분자일수록 낮은 농도의 gel을 사용하는 것이 일반적입니다. 다만, 농도가 너무 낮은 gel을 제조할 경우, 겔화가 될지라도 다루기 힘들 정도로 쉽게 깨질 우려가 있고, 거의 사용하지 않습니다. 그 이유도 있지만, DNA work을 하다 보면 거의 10 KDa 이하로 다루기 때문에, 더 낮은 농도가 필요할 일은 딱히 없습니다.
Agarose gel 제조 방법 (예시 1% agarose gel, 60 mL)
- Agarose gel을 만들 때에는 실험실에서 가지고 있는 틀을 먼저 조립해줍니다.
- 삼각플라스크에 1X TAE buffer를 60 mL 넣어줍니다.
- Agarose powder를 0.6g을 계량하여 삼각플라스크에 넣어줍니다.
- 전자레인지에 넣기 전에, agarose 액체가 튀는 것을 방지하기 위해서 뚜껑에 랩을 싸서 구멍을 몇 개 뚫어줍니다.
- 1분 30초 정도 돌려줍니다.
- 꺼낼 때는 화상방지 장갑을 낀 상태에서 꺼내고, EtBr 또는 200X staining solution을 150 uL 넣어줍니다.
- 흔들어 잘 섞은 후에, 조립해둔 틀에 부어줍니다. (comb가 거의 잠기도록 부어주면, 더 깊은 well을 만들어줄 수 있습니다.)
- 실온에서 천천히 식혀주면 30분 이내에 고체화된 agarose gel이 됩니다. (만일 아래의 제품 사용 시, 감광성이 있기 때문에 빛을 차단해주는 포일이나 덮개를 씌운 상태에서 식혀주어야 합니다.)
저는 암 유발 물질인 EtBr의 사용하기보다는 아래의 대체품을 사용하는 것이 건강에 좋을 듯합니다. 절대 홍보는 아닙니다.
https://www.bioneer.co.kr/20-c-9036.html
GreenStar™ Nucleic Acid Staining Solution I
www.bioneer.co.kr
준비물
- Agarose
- 1X TAE buffer
- 전자레인지
- Agarose gel 전용 틀
- 삼각 플라스크
- Staining solution
DNA 농도별 적합한 agarose gel 농도
- 0.5%, 1,000 ~ 30,000 bp
- 0.8%, 800 ~ 12,000 bp
- 1.0%, 500 ~ 10,000 bp
- 1.5%, 200 ~ 3,000 bp
- 2.0%, 50 ~ 2,000 bp
저의 경우, 목적하는 DNA의 크기를 고려하여 gel의 농도를 선택할 때는 전기영동의 시간을 단축시키는 것에 중점을 두는 편입니다. 만일 500 bp의 band를 보고자 할 때, 1~1.5%의 gel도 분석이 가능하지만, 1%의 gel을 만들어야 전기영동 시 band가 빠르게 내려옵니다.
Gene cloning을 하시는 분들은 모두 하시게 될 agarose gel 제조에 대해서 한 번 다뤄 보았습니다. 최대한 간결하게 적었고, 잡다한 정보는 뺐습니다. 그래도 알면 좋을 것들은 조금 넣었으니, 유익한 정보가 되었길 바랍니다. 그리고 한 번에 실험이 되지 않더라도, 실패도 좋은 경험이 되니까 힘내시길 바랍니다.
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